[테라젠바이오-테라노트] HBV 통합체에서 계속 나오는 항원… Long Read로 밝힌 전사 메커니즘

안녕하세요, 테라노트 입니다! Long Read로 밝힌 전사 메커니즘을 알아봅시다 :)

2025. 6. 25.

안녕하세요 😊 테라노트 입니다.📖

오늘은 만성 B형 간염(CHB) 환자의 간 조직에서 HBV(hepatitis B virus)의 게놈 통합(integration) 및 이로 인해 발생하는 염색체 전좌(translocation) 현상을 long-read sequencing 을 이용해 분석한 연구를 소개해 드립니다.

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<논문제목 : Targeted long-read sequencing reveals clonally expanded HBVassociated chromosomal translocations in patients with chronic hepatitis B>

이 연구는 간세포암(HCC)이 아닌 만성 B형 간염(CHB) 환자의 간 조직에서 HBV 관련 염색체 간 전좌가 존재하며, 이러한 전좌가 클론 확장에 관여한다는 점을 규명했습니다. 또한 HBeAg 음성 환자에서는 전체 HBV 전사체의 대부분이 숙주 유전체에 통합된 HBV DNA에서 유래함을 확인했습니다.

연구방법)

이 연구는 GS-US-174-0149 임상시험의 만성 B형간염 환자 간 생검 123건 중, RNA 품질(RIN > 8.5)을 만족한 fresh-frozen 시료 53건만을 대상으로 하였습니다. 이 가운데 gDNA 42건은 평균 7.5 kb로 절단 후 정제하였고, 동일 시료의 RNA 43건은 SMARTer 키트로 전장 cDNA로 합성하였습니다.

HBV 전장 유전체 144종과 숙주 유전자 16종을 포함한 총 160개의 120-mer 바이오틴화 프로브를 설계하여, gDNA와 cDNA를 동일 프로브로 캡처한 뒤 증폭하여 PacBio Sequel II에서 long-read 시퀀싱을 수행하였습니다. 비교를 위해 53건 전량에 대해 TruSeq 키트로 Illumina short-read RNA-seq를 수행하였습니다.

▼ 그림 1. CHB 환자 간 조직에서의 HBV 통합 및 염색체 간 전좌 구조 분석

그림 1은 CHB 환자의 간 조직에서 확보한 HBV 통합·전좌의 구조적 다양성을 Targeted Long-read Seq 데이터를 기반으로 시각화한 자료입니다.

(A), (B)는 조립된 contig를 기반으로, HBV DNA가 인간 유전체에 삽입된 구조를 시각화 한 것으로, 삽입된 HBV 서열 양쪽에 숙주 염기서열이 인접하고 ≥25 reads로 지지된 contig만 포함되었습니다.

(A) 단일 염색체 상에서의 일반적인 통합 구조 (intra-chromosomal integration). 환자마다 고유한 양상을 보이며, 일부 통합체는 전체 HBV 유전체(DR1*-DR1구조)를 포함한 반면, 대부분은 Core, X ORF**가 절단된 형태의 부분 유전체로 구성됨.

→ HBV 통합이 표준화된 패턴 없이 다양한 구조적 형태로 발생함

(B) 서로 다른 두 염색체를 연결하는 전좌형 통합 구조 (inter-chromosomal translocation).

전체 42샘플 중 13개에서 염색체 간 전좌 현상이 관찰됨. 이는 HBV DNA가 염색체 재배열 과정에 직접 관여했음을 시사.

→ 기존 short-read 기반 분석에서는 일부 virus-host junction만 확인되는 반면, long-read 시퀀싱에서는 full-length HBV + 양쪽 숙주 염색체 서열이 연결된 구조가 확보되어 염색체 간 전좌를 분자 수준에서 정확히 규명됨을 확인.

*DR1(Direct Repeat 1): HBV 유전체 내 반복 부위 중 하나로 약 11개 염기쌍 정도의 짧은 서열. dslDNA 형성 시 DR1이 시작 및 종료 지점으로 사용됨, HBV가 숙주 유전체에 통합 시 주요 삽입 시작점(hotspot).

**ORF(Open Reading Frame): 유전체로부터 mRNA가 전사되고 단백질 생합성 기구에 의해 단백질로 번역될 가능성을 가진 코돈. 시작코돈부터 종결코돈까지의 아미노산을 암호화하는 코돈이 연속적인 배열을 가짐.

▼ 그림 2. 통합체 vs. cccDNA 유래 HBV 전사체 분석

그림 2는 Long-read RNA-Seq 기반 분석을 통해 CHB 환자 간 조직 내 HBV RNA 전사체의 전체 길이를 시퀀싱한 결과입니다. 특히 probe-based enrichment를 통해 HBV 유래 전사체만을 선택적으로 수집하여, RNA 기원(cDNA vs. integration)을 구별했습니다.

(A) HBV RNA의 3’ 말단 구조를 통한 전사체 기원 구분

HBV 전사체가 어떤 유전적 출처에서 유래했는 지 구별하는 단서인 전사체의 3' 말단 구조를 비교한 결과, cccDNA*와 통합된 HBV DNA 각각에서 유래한 RNA 전사체는 서로 다른 위치에서 전사를 종결함을 확인.

통합된 HBV DNA 유래 RNA는 두 가지 형태로,
(1) Chimeric transcript: HBV-숙주 유전체를 이어 전사되며, 인접 숙주의 poly(A) 신호에서 종결됨. 숙주 서열이 전사체 말단에 포함됨.
(2) Non-chimeric transcript: 숙주 유전체 서열은 포함되지 않으며, HBV X ORF 내 비표준 poly(A)에서 종결됨.
(3) HBV RNA가 cccDNA에서 유래한 경우, 표준 poly(A) signal (X ORF downstream)에서 종결됨.

→ 이 구조적 차이를 기반으로 Long-read RNA Seq 데이터 기반으로 HBV 전사체의 3’ 말단 분석을 통해 RNA의 기원을 구분했습니다.

*cccDNA(Covalently Closed Circular DNA): 공유결합으로 닫힌 원형 DNA.

▼ 그림 3. HBV 통합체 전사 활성 및 클론 확장

그림 3은 HBV 통합체가 실제로 전사되고, 동일한 통합체를 가진 세포들이 클론 확장까지 이어지는 연결고리를 보여줍니다. HBeAg 음성인 환자로부터 확보한 동일 시점의 FFPE와 fresh frozen 간 샘플로 분석한 결과입니다.

1) 왼쪽위 그림: HBV 통합체의 전좌 구조 (Chr1-Chr18)

약 3.2kb의 virus-host junction 을 통해 HBV 통합체가 Chr1과 Chr18 사이에서 전좌된 구조임을 확인(빨간색 대각선이 이 두 염색체 간 연결을 나타냄).
다양한 long-read에서 동일한 구조가 그래프와 같은 구조로 반복적으로 확인되어 정밀한 통합체 재구성이 가능했음.

-x축: 숙주 염색체 위치

-y축: HBV 유전체 상의 위치 (DR1, DR2, Core, S, X ORF)

2) 오른쪽 그림: HBV 통합체의 전사 활성

Long-read DNA Seq로 통합 구조를 재현한 서열을 확보.
Targeted Iso-Seq (Long-read RNA Seq) 결과,
HBV 서열이 숙주 유전체(Chr18)로 이어지는 chimeric 전사체로 전사하며, 숙주 poly(A) 에서 전사 종결됨(형광색)을 확인.
Short-read RNA Seq 에서도 동일한 위치에서 전사 신호가 검출됨. 이는 통합체가 실제로 전사 활성 상태임을 입증.

→ HBV 통합체가 단순 삽입된 구조가 아닌, 숙주 유전체 내에서 기능적으로 전사되는 것을 확인했습니다.

3) 왼쪽아래 그림: 단백질 수준 발현 및 클론 확장

- 면역염색법을 사용하여 HBsAg 단백질을 염색한 결과, 조직 내에서 patch 형태의 고발현된 영역(HBsAg, 왼쪽 사진 고동새그 오른쪽 사진 초록색)이 관찰됨.

이는 해당 HBV 통합체를 가진 간세포가 클론성으로 증식(clonal expansion)됨을 시사함.

결론으로 본 연구는 long-read sequencing을 통해 HBV 통합체가 실제로 전사되고, 간세포 내에서 클론성 확장을 일으킬 수 있음을 입증하였으며, 이는 만성 B형간염 환자에서 HBV 통합체의 병리적 역할과 임상적 중요성을 강조하고 있습니다.

*HBsAg(Hepatitis B surface antigen): 몸 안에 B형 간염 바이러스가 있다는 존재 자체를 알려주는 표면 마크.