University of Virginia School of Medicine의 연구진은 Pacific Biosciences의 full-length RNA 시퀀싱을 사용하여 줄기세포주에서 특정 단백질 아이소폼을 더 정확히 타겟팅하는 데 성공했습니다. 본 연구는 RNA 시퀀싱과 질량분석(mass spectrometry)을 결합함으로써 기존에는 관찰되지 않았던 단백질 복잡성을 탐색할 수 있음을 보여줍니다. 많은 RNA 아이소폼이 실제 단백질로 번역되었으며, 대부분이 검증되었습니다.
연구진은 RNA 데이터를 이용해 단백질 아이소폼을 예측하고, 이를 내부표준 병렬반응모니터링(IS-PRM*)이라는 질량분석 기법으로 검출했습니다. 예측된 펩타이드를 합성하여 spike-in 형태로 투입함으로써 검출률을 3.6배 향상시켰고, 그 결과 새로운 아이소폼 5종을 포함하여 총 54개의 식별된 아이소폼 중 43개에 대한 단백질 발현을 확인할 수 있었습니다.
이 방법은 기존 질량분석 방식보다 저농도의 펩타이드를 효과적으로 검출할 수 있으며, 질병 관련 신호전달 경로를 밝히는 데 도움을 줍니다. RNA 데이터에서 유래한 단백질 아이소폼의 존재 여부를 명확히 하며, 이는 암 생물학적 이해, 바이오마커 탐색, 신항원 발굴에 기여할 수 있습니다.
기존 질량분석은 샘플 전체를 분석해 수백만 개의 펩타이드를 생성하지만, 실제 아이소폼 식별이 가능한 isoform-specific peptide는 1% 미만입니다. 이번 연구는 PacBio의 Kinnex kit 를 사용해 long-read RNA 시퀀싱 라이브러리를 사용했으며, Oxford Nanopore 기술도 활용 가능성이 있지만 PacBio의 HiFi 정확도와 낮아진 비용, 긴 리드 길이의 장점을 고려하여 Pacbio의 장비를 채택하였습니다.
연구 방법은 샘플 특이적인 단백질 아이소폼 데이터베이스를 생성하며, RNA 데이터만 확보되면 타겟 리스트는 빠르게 만들 수 있습니다. 다만, 합성 펩타이드 생산은 비용과 시간이 많이 소요됩니다. 이에 대한 대안으로 GoDig**와 같은 표준 없이 작동하는 타겟 질량분석 방법도 제시되고 있습니다.
단기적으로는 펩타이드 검출, 아이소폼 검증 및 annotation이 가능하며, 장기적으로는 개별 환자 단위의 맞춤형 프로테옴 구현을 목표로 합니다. 이는 질병 아이소폼 특이적 단백질을 밝혀내거나, 아이소폼 특이적 치료제 개발에도 활용될 수 있습니다.
기존 질량분석 방법인 shotgun proteomics, DDA(Data-Dependent Acquisition) 방식에서는 생물학적 중요성 보다는 이온화 효율 (ionization efficiency), 분해 패턴 (fragmentation behavior), 소수성/극성 등의 물리적 특성에 의해 펩타이드가 검출되는 경우가 많았습니다.
일반적으로 질병과 더 밀접하게 관련된 펩타이드는 이온화 효율이 낮은 것으로 보고되었습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 연구에서는 IS-PRM, GoDig 과 같은 타겟 기반 질량 분석법을 사용하여 정밀도를 높였습니다.
해당 논문의 저자가 밝힌 최종 목표는 단백질 아이소폼 특이적 바이오마커를 포함한 타겟 패널을 개발하는 것입니다. long-read RNA 시퀀싱과 단백질 서열 분석 같은 top-down proteomics***(전체 단백질 단위의 시퀀싱 기반 분석)를 결합하면, DNA에서 RNA, 그리고 단백질로 이어지는 생물학적 정보 흐름을 보다 명확히 이해할 수 있을 것으로 기대됩니다.
관련 논문:
IS-PRM-Based Peptide Targeting Informed by Long-Read Sequencing for Alternative Proteome Detection (2024). DOI: 10.1021/jasms.4c00119
*IS-PRM: Internal Standard-triggered Parallel Reaction Monitoring
**GoDig: Guided Data-Independent Acquisition with Internal Standards. 내부표준(Internal Standard) 펩타이드를 이용하여, DIA (Data-Independent Acquisition) 기반 질량분석에서 원하는 타겟 펩타이드를 실시간으로 선택적 탐지하는 기법.
***top-down proteomics: 단백질을 펩타이드 단위로 분해하지 않고, 단백질 전체를 직접 질량 분석하는 기법. | 
