안녕하세요 😊 테라노트 입니다.📖

• (그림1.A) 염기수정 (Base modification)
  ① 포르말린이 A/C/G 염기의 아민기(NH₂)와 반응을 해서, 결합을 하고, DiHydroxy-methyl species 구조를 이룸 
  ② DiHydroxy-methyl species 구조가 H₂O와 결합하면, Imine 구조로 변하고, Imine에서 H₂O가 떨어져나가면, 다시 DiHydroxy-methyl species 구조가 됨
• (그림1.B) 공유결합 형성 (Covalent cross-linkage)
  

  (A)과정으로 생성된 DiHydroxy-methyl species와 Imine 구조가 Methylene bridge를 형성하면서, 마주보는 G-C염기 간 수소결합이 공유결합으로 바뀌게 됨.

  ➜ 이중가닥이 분리가 안되어서 시퀀싱 불가

• (그림1.C) 염기 절제 (Base excision)
  

  A/T/C/G 염기와 당의 결합(N-glycosylic bond)이 가수분해 되면서 당-염기 사슬이 끊어지고, 염기가 소실된 AP site가 발생됨.

  ➜ 염기가 소실되어 해당 영역 시퀀싱 불가
  
• (그림1.D) 폴리데옥시리보스 파편화 (Polydeoxyribose fragmentation)
  

  ① 당과 연결된 인산의 산소에 수소이온이 결합하면서, 당-인산 사슬이 끊어지게 됨.

  ② DNA Fragmentation이 일어남.

  ➜ DNA Fragment size 짧아짐.

• (그림1.E) 시토신 탈아미노화 (Cytosine deamination) 
  

  ① C가 H₂O와 결합하면서, Deamination되어, U가 됨.

  ② PCR을 돌리면, U가 A로 합성됨(C>T/G>A).

  ➜ 실제 시퀀싱 과정에서 Artifact와 PCR 오류를 유발함.
  (Sequence와 다른 염기로 시퀀싱)

• (그림2.A) FFPE에서 관찰된 Artifact의 비율
  

  FFPE에서 가장 흔한 Artifact 유형은 C>T/G>A로, 이는 Cytosine deamination로 발생한 변이

• (그림2.B) FF대비 FFPE에서 관찰된 Artifact의 증가율
  C>T/G>A의 경우, FF와 비교했을 때 7배 증가
  
• (그림2.C) FFPE Artifact별 AF 분포
  FFPE Artifact의 AF(Allele Frequency)는 대체로 1% 미만이나, 10%를 초과하는 경우도 있음
• (그림2.D) Sequence Duplicate Ratio
  FFPE는 FF에 비해 중복된 시퀀스 비율이 2배 가량 높음
• (그림2.E) Library Insert Size
  FFPE는 심각한 fragmentation으로 인해 FF에 비해 절반수준으로 감소
• (그림2.F) Coverage Bias
  FFPE샘플은 FF샘플에 비해 Coverage Uniformity가 낮음(불균형)