안녕하세요, 테라노트 입니다! 놓쳤던 원인 변이까지, Long-read WGS의 새로운 가능성
안녕하세요 😊 테라노트 입니다.📖
오늘은 WES나 Short-read WGS로도 원인 변이를 찾지 못했던 희귀질환 환자를 대상으로, Long-read WGS를 통해 새로운 원인 변이를 발견하고 진단율을 향상시킨 연구를 소개해드리겠습니다.
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해당 연구는 기존 WES(Whole Exome Sequencing) 또는 Short-read WGS로도 원인을 찾지 못한 희귀질환 환자에서 PacBio HiFi Long-read Whole Genome Sequencing이 추가적인 진단 가치를 제공하는지 평가하였습니다.
🔬 연구 방법
연구진은 기존 WES, WGS 및 유전자 패널 검사에서도 원인을 찾지 못한 114개 희귀질환 가족(293명)을 대상으로 PacBio HiFi Long-read WGS를 수행했습니다.
각 샘플은 평균 10× coverage로 분석했으며, SNV, Indel, 구조변이(SV), STR expansion을 함께 확인했습니다.
발견된 후보 변이는 가족 내 유전 양상과 임상 표현형을 평가한 뒤, PCR, Sanger sequencing, RNA-seq, OGM 등을 통해 검증했습니다.
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▲ 그림 1. Long-read sequencing으로 다양한 구조변이를 정확하게 규명 |
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그림 1은 Long-read sequencing이 inversion, exon deletion, tandem duplication과 같은 다양한 구조변이를 정확하게 규명하고, breakpoint 확인부터 가족 내 검증, 임상 표현형 재해석까지 가능하게 함으로써 희귀질환 진단의 정확도를 높일 수 있음을 보여주는 대표적인 사례입니다.
A–B | Long-read로 대형 inversion의 정확한 breakpoint 규명
- 기존 Short-read sequencing에서는 copy number 변화가 없는 inversion(역위)을 정확하게 검출하기 어렵습니다. 특히 수 Mb 규모의 inversion은 존재를 추정할 수는 있지만, breakpoint를 정확히 확인하기는 쉽지 않습니다.
- 환자(P0078963)에서는 약 8.7 Mb inversion이 발견되어 DMD 유전자의 intron 44가 절단되었으며, 정상적인 dystrophin 단백질을 생성하지 못하는 truncated transcript가 형성되었습니다.
- 기존 Optical Genome Mapping(OGM)으로는 inversion의 존재만 확인할 수 있었지만, HiFi Long-read sequencing을 통해 breakpoint를 염기 수준까지 정확하게 규명하였습니다.
E–H | 단일 exon deletion도 정확하게 검출
- Long-read sequencing은 대형 구조변이뿐 아니라 단일 exon 수준의 작은 deletion도 정확하게 검출할 수 있습니다.
- 유전성 강직성 하반신마비(HSP) 환자 가족에서는 REEP1 exon 6 전체가 삭제된 약 1.2 kb deletion이 확인되었습니다.
- 이 변이는 frameshift mutation을 유발하여 조기 종결코돈(premature stop codon)을 생성하고, 결과적으로 정상 단백질의 생성이 불가능해집니다.
- Long-read alignment에서는 deletion을 포함하는 read를 직접 확인할 수 있었으며, 이후 PCR과 gel electrophoresis를 통해 동일한 변이가 환자인 아버지와 아들에게 모두 존재함을 확인하여 병원성 여부를 추가적으로 검증하였습니다.
I–K | Duplication의 존재를 넘어 구조까지 규명
- 구조변이에서는 duplication이 존재하는지뿐 아니라 어떤 형태로 duplication이 발생했는지를 확인하는 것이 매우 중요합니다.
- 성인 발병 근병증 환자에서는 기존 gene panel 검사로 MYOT 유전자의 약 65 kb duplication이 확인되었지만, tandem duplication 여부는 알 수 없었습니다.
- 연구진은 Long-read 원시(read) 데이터를 재분석하여 해당 duplication이 tandem duplication임을 확인하였으며, 동일한 변이가 영향을 받은 형제에서도 확인되어 질환과의 연관성을 뒷받침하였습니다.
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▲ 그림 2. Long-read sequencing으로 Deep intronic variant와 Variant Phasing까지 확인 |
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그림 2는 Long-read sequencing이 기존 검사에서 놓치기 쉬운 deep intronic variant를 검출하고, 수십 kb 이상 떨어진 두 변이의 염색체 위치(phasing)까지 확인함으로써 희귀질환의 유전적 원인을 보다 명확하게 규명할 수 있음을 보여주는 사례입니다.
A–B | Deep intronic variant를 발견하여 희귀질환 진단 확정
- 기존 Whole Exome Sequencing(WES)은 exon 중심으로 분석하기 때문에, 깊은 intron(deep intronic region)에 존재하는 병원성 변이를 발견하기 어렵습니다.
- 본 연구에서는 Becker muscular dystrophy(BMD)가 의심되는 환자에서 DMD 유전자의 deep intronic variant(c.31+36947G>A)를 확인하였습니다. 이 변이는 이전 연구에서 149 bp 크기의 pseudoexon 생성을 유도하여 비정상적인 dystrophin 단백질을 생성하는 병원성 변이로 보고된 바 있습니다.
- HiFi Long-read sequencing을 통해 해당 변이를 확인한 후 환자의 임상 증상을 다시 평가한 결과, 최종적으로 Becker muscular dystrophy로 진단을 확정할 수 있었습니다.
E–G | Long-read Phasing으로 두 병원성 변이의 위치를 확인
- 희귀질환에서는 병원성 변이가 같은 염색체(cis)에 존재하는지, 서로 다른 염색체(trans)에 존재하는지를 확인하는 것이 매우 중요합니다.
- Titinopathy 환자에서는 TTN 유전자에서 두 개의 frameshift mutation이 이미 확인되어 있었지만, 기존 Short-read sequencing으로는 두 변이가 약 111 kb 떨어져 있어 서로 같은 염색체에 존재하는지 여부를 판단할 수 없었습니다.
- HiFi Long-read sequencing은 긴 read를 이용해 두 변이를 하나의 haplotype으로 연결하였으며, 두 변이가 서로 다른 염색체(trans)에 존재함을 확인하였습니다. 이를 통해 환자가 compound heterozygous mutation을 가지고 있음을 입증하였고, 최종적으로 유전적 진단을 확정할 수 있었습니다.
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이 연구는 HiFi Long-read sequencing을 통해 기존 WES, WGS 및 유전자 패널 검사에서도 원인을 찾지 못했던 93개 희귀질환 가족 중 11개 가족(11.8%)에서 새로운 유전적 진단을 내렸으며, 추가로 5개 가족(5.4%)에서는 새로운 원인 후보 변이를 발견하였습니다.
특히 구조변이(SV), STR expansion, deep intronic variant, variant phasing과 같이 기존 Short-read sequencing으로는 검출하거나 해석하기 어려운 다양한 병원성 변이를 효과적으로 규명하였으며, 평균 약 10×의 HiFi Long-read sequencing만으로도 희귀질환의 진단율을 향상시킬 수 있는 가능성을 입증하였습니다. |
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그럼 다음 테라노트에서 뵙겠습니다. 😉
테라노트 올림
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