안녕하세요, 테라노트 입니다!
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FFPE(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) 샘플은 비용이 저렴하고 보관이 용이하여 임상 현장에서 널리 활용되고 있습니다. 그러나 포르말린 처리 과정에서 DNA에 다양한 화학적 변형이 발생하며, 이로 인해 시퀀싱 과정에서 오류(Artifact)가 유발되어 정확한 변이 분석에 어려움이 있습니다.
테라젠바이오에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 DEEPOMICS® FFPE 서비스를 개발하여 제공하고 있습니다. DEEPOMICS® FFPE는 WES뿐만 아니라 WGS 데이터에서도 FFPE 유래 Artifact(인공변이)를 효과적으로 제거하는 동시에, True variant(체세포 변이)를 최대한 보존하는 딥러닝 기반 모델입니다.
최근 DEEPOMICS® FFPE의 우수성이 입증된 해외 논문이 발표되어 이번 테라노트를 통해 소개드리겠습니다!
지난 테라젠바이오 뉴스레터에 대해 궁금하신 분들은 아래 링크를 통해 확인해주세요!
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본 연구의 목적은 유방암 FFPE 샘플에서 얻은 DNA 시퀀싱 데이터를 이용해 종양의 분자 진화(molecular evolution)를 분석하는 것으로, Artifact를 제거하면 FFPE 샘플도 임상 데이터로 충분히 활용 가능함을 보여줍니다.
🔬 연구 방법
본 연구에서는 유방암 환자 15명을 대상으로, 각 환자에서 원발 종양(primary tumor, P1)과 림프절 전이 조직(lymph node metastasis, L1)을 모두 수집하여 원발암과 전이암 간 paired 분석을 수행하였습니다.
DNA 시퀀싱은 100X 이상의 depth를 가지는 Whole Exome Sequencing(WES)으로 진행되었으며, Alignment(BWA), Variant Calling(MuTect2), Annotation(VEP)을 포함한 표준 NGS 분석 워크플로우를 적용하였습니다.
FFPE 샘플은 고정 과정에서 발생하는 DNA 손상으로 인해 C>T 및 G>A 변이가 증가하고, 이로 인해 false positive 변이가 다량 발생하는 문제가 있습니다. 따라서 이러한 artifact를 제거하는 과정은 전체 분석에서 가장 핵심적인 단계입니다.
본 연구에서는 artifact를 제거하면서 실제 변이를 최대한 보존하기 위해 다음과 같은 필터링 도구를 적용하고 그 결과를 비교하였습니다.
이후, SNV 분석, VAF/SFS 기반 진화 분석, 그리고 CNV 분석을 통합적으로 수행하여 종양의 클론 진화 구조와 성장 속도를 정량적으로 평가하였습니다.
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▲그림1. 세가지의 필터링 도구 적용 후 variant 수 [출처 1] |
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FFPE 샘플에서 발생하는 artifact 제거 성능을 비교하기 위해 SOBDetector, FFPolish, DEEPOMICS 세 가지 필터링 도구를 적용하여 변이 개수와 mutation pattern을 분석하였습니다.
본 비교에서는 DEEPOMICS의 기본 threshold(FFPE score 0.5) 대신, 변이 수 확보 및 분석 가능성을 고려하여 threshold를 0.25로 조정한 결과를 사용하였습니다. (그림1 내 표기 기준)
먼저, 최소 coverage(≥10)를 기준으로 필터링한 데이터를 “unfiltered” 기준으로 설정한 결과, 샘플당 평균 약 7,500개의 변이가 검출되었습니다. 이는 TCGA의 fresh frozen 샘플에서 관찰되는 평균 약 450개의 변이 수와 비교할 때 비정상적으로 높은 수준으로, FFPE 처리 과정에서 발생한 artifact가 대량 포함된 결과임을 보여줍니다.
각 필터링 도구의 결과는 다음과 같습니다.
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SOBDetector: 약 4,000개의 변이를 유지하여 상당수의 artifact를 제거하지 못했으며, 실제 신호와 노이즈를 충분히 구분하지 못하는 한계를 보였습니다.
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FFPolish: primary tumor(P1)에서 평균 141개, lymph node(L1)에서 124개의 변이만을 남겨 실제 변이까지 과도하게 제거하는 경향을 보였습니다.
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DEEPOMICS / DEEPOMICS Plus: 평균 200~250개의 변이를 유지하면서도 artifact를 효과적으로 제거하여, 데이터 보존과 정확도 측면에서 가장 균형 잡힌 결과를 제공하였습니다.
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▲그림2. 세포 간 상호작용 분석 예시 figure [출처 1] |
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필터링 성능을 보다 정밀하게 평가하기 위해 SNV의 염기 치환 패턴을 분석하고 이를 TCGA 데이터와 비교한 결과, FFPE 샘플에서는 C>T 및 G>A 변이가 과도하게 증가하는 특이적 패턴이 뚜렷하게 나타났습니다.
SOBDetector는 이러한 artifact 패턴을 충분히 제거하지 못하였으며, FFPolish는 일부 개선된 결과를 보였으나 변이 수 감소가 지나치게 큰 한계를 보였습니다.
반면, DEEPOMICS는 mutation 분포가 TCGA 데이터와 가장 유사하게 나타나, 실제 생물학적 신호를 가장 정확하게 복원하는 필터링 성능을 입증하였습니다.
이러한 결과를 바탕으로 후속 분석에는 DEEPOMICS를 선택하였습니다.
이후 후속 분석을 위해 DEEPOMICS의 threshold를 조정한 결과, 필터링 효율을 유지하면서도 분석에 필요한 충분한 변이 수를 확보할 수 있었습니다.
구체적으로, threshold 0.25 조건에서 primary tumor에서 평균 453개, lymph node에서 511개의 변이를 확보하였으며, 필터링 효율을 유지하면서도 분석에 충분한 데이터 양을 확보할 수 있었습니다.
종합적으로, FFPE 데이터 분석에서는 필터링 도구 선택이 결과의 신뢰도를 결정짓는 핵심 요소이며,
본 연구에서는 DEEPOMICS가 artifact 제거 정확도와 데이터 보존 간 최적의 균형을 제공하는 가장 우수한 필터링 도구로 확인되었습니다. |
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📊 연구 결과 및 결론
이후 CNV 분석, mutation spectrum 분석, SFS 기반 분석을 통합적으로 수행하여 종양의 진화 양상과 전이 메커니즘을 규명하였습니다.
종합적으로, FFPE 데이터는 기술적 한계를 가지지만, 적절한 필터링과 분석을 통해 종양의 클론 구조, 유전체 변화, 그리고 진화적 특성을 충분히 복원할 수 있음을 확인하였습니다.
또한 본 연구를 통해 DEEPOMICS가 FFPE 데이터 분석에서 정확도와 데이터 보존 측면을 동시에 만족하는 가장 효과적인 필터링 전략임이 입증되었습니다.
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💡 분석뿐 아니라 실험까지 차별화된 FFPE 솔루션, 테라젠바이오
테라젠바이오는 FFPE 샘플에서 변이 발굴의 정확도를 높이기 위해
DEEPOMICS® FFPE 분석뿐 아니라, 실험 단계에서도 차별화된 접근법을 적용하고 있습니다.
특히 DNA 추출 과정에서 HiTE(Highly concentrated Tris-mediated extraction) 기법과 Nuclease P1 처리를 추가로 적용하여, FFPE 유래 artifact를 효과적으로 감소시켰습니다.
아래 그림 3에서 확인할 수 있듯이, HiTE + P1 적용 시 인공변이(artifact)가 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있습니다.
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▲그림3. DNA 추출 kit별 변이 수 [출처 테라젠바이오] |
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이처럼 테라젠바이오는 FFPE 샘플의 변이 검출 신뢰도를 높이기 위해
실험 단계와 분석 단계 모두에서 최적화를 구현한 통합 솔루션을 제공합니다.
추가적으로 궁금하신 사항은 이메일 또는 아래 ‘서비스 문의’ 버튼을 통해 문의해주시면 안내드리겠습니다.
그럼 다음 테라노트에서 뵙겠습니다. 😉
테라노트 올림
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